(PDF) Obtención de células madre mesenquimales a partir de ... · las enfermedades autoinmunes23. Documento descargado de el 20/03/2013. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión

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Inmunologíawww. elsev ier .es / inmunologia

riginal

btención de células madre mesenquimales a partir deordones umbilicales procedentes de un programa altruistae donación de sangre de cordón

ina Arbósa,b, Francesca Nicolaua, Marta Quetglasa, Joana Maria Ramisb,arta Monjob, Josep Muncunill c, Javier Calvoa,b y Antoni Gayàa,b,∗

Banc de Teixits, Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears, Palma de Mallorca, EspanaTerapia Celular e Ingeniería Tisular (TERCIT), Instituto Universitario de Investigación en Ciencias de la Salud (IUNICS), Universitate les Illes Balears (UIB), Palma de Mallorca, EspanaBanc de Sang, Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears, Palma de Mallorca, Espana

nformación del artículo

istoria del artículo:

ecibido el 6 de julio de 2012

ceptado el 16 de noviembre

e 2012

n-line el 10 de enero de 2013

alabras clave:

élulas madre mesenquimales

ordón umbilical

iobanco

edicina regenerativa

r e s u m e n

Introducción: Las células madre mesenquimales (CMM) muestran un gran potencial en el

campo de la medicina regenerativa debido a su alta plasticidad y a su capacidad de modular

la respuesta inmune. La fuente más habitual de obtención es la médula ósea. aunque se ha

puesto en evidencia la necesidad de una fuente alternativa de CMM rápida y sencilla. Uno

de los primeros candidatos fue la sangre del cordón umbilical (SCU) pero se ha demostrado

que el rendimiento de recuperación de CMM es bajo.

Material y métodos: En el presente trabajo hemos analizado la obtención de CMM utilizando

como tejido fuente el cordón umbilical (CU). Todas las muestras se obtuvieron a partir de

las donaciones incluidas en nuestro programa altruista de donación de SCU.

Resultados: Los resultados muestran que es posible obtener CMM a partir de CU (CMM-CUh)

con una tasa de éxito del 100%, mediante una combinación de fragmentación mecánica

y digestión enzimática. Las CMM-CUh obtenidas muestran el fenotipo propio de las CMM

de médula ósea: CD45−CD31−CD34−HLA-DR− y CD105+CD90+CD73+. Además, al igual que

las CMM de médula ósea, las CMM-CUh son capaces de diferenciarse en osteoblastos y

adipocitos, y ejercer un efecto supresor de la capacidad proliferativa de los linfocitos de

sangre periférica estimulados con fitohemaglutinina.

Conclusiones: En conclusión, es posible establecer un programa estructurado de obtención

de CMM utilizando la misma logística que se usa para obtener las unidades de SCU. Este

hecho abre las puertas al desarrollo de un biobanco de CMM humanas que puedan ser

suministradas a proyectos de investigación y para su uso clínico terapéutico.

∗ Autor para correspondencia.Correo electrónico: [emailprotected] (A. Gayà).

dx.doi.org/10.1016/j.inmuno.2012.11.002

http://www.elsevier.es/inmunologia

mailto:[emailprotected]

dx.doi.org/10.1016/j.inmuno.2012.11.002

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Mesenchymal stem cell derivation from umbilical cord tissue obtainedfrom an altruistic cord blood donation

Keywords:

Mesenchymal stem cells

Umbilical cord

Biobank

Regenerative medicine

a b s t r a c t

Introduction: Mesenchymal stem cells (MSC) offer a great potential for regenerative medicine

due to their unique properties of self-renewal, high plasticity and modulation of immune

response. Although the original source of MSC has been bone marrow, there is a clear need

for a source of MSC as an “off-the-shelf” product for quick and effective treatment. One of

the first candidates was the umbilical cord blood (UCB) but the poor recovery discourages

its use.

Material and methods: In the present paper, we tested umbilical cord (UC) tissue as a source for

obtaining MSC. All the samples were obtained from donations included in our UCB altruistic

procurement program.

Results: Our results showed that is possible to obtain MSC from UC (hUC-MSC) with a 100%

success rate by using a combination of mechanical fragmentation and enzymatic digestion.

The MSC thus obtained show a phenotype very similar to that observed in the MSC of

bone marrow origin: CD45−CD31−CD34−HLA-DR-CD−105+CD90+CD73+. In addition, we have

demonstrated that hUC-MSC, like the MSC from bone marrow, are able to differentiate into

osteoblasts and adipocytes, and also exert a suppressive effect on the proliferative capacity

of peripheral lymphocytes stimulated with phytohaemagglutinin.

Conclusions: We conclude that it is possible to implement a structured program of MSC

derivation by using the same logistics that are used to obtain UCB. This opens the way

to developing a biobank of human MSC that could be useful for research and clinical use.

reserved.

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Introducción

Las células madre se definen como aquellas células queposeen capacidad clonogénica, de autorrenovación y de dife-renciación en múltiples linajes celulares. Mientras que lascélulas madre embrionarias se derivan del blastocisto de losembriones de mamíferos y tienen la capacidad de generarcualquier célula diferenciada del cuerpo, las células madreadultas se localizan en los diferentes tejidos del organismoposnatal y se encuentran comprometidas a diferenciarse enel propio linaje. La función primordial de estas células esmantener, generar y reemplazar las células diferenciadas decada tejido como consecuencia de la autorrenovación tisularfisiológica o de la respuesta al dano tisular secundario a unaagresión.

El ejemplo más evidente y conocido lo encontramos enla médula ósea adulta, ya que contiene varias poblacionesde células madre multipotentes. Estas células se caracteri-zan por su capacidad de autorrenovación y por su capacidadpara diferenciarse en al menos un tipo celular maduro. Ade-más de las células madre hematopoyéticas, la medula óseacontiene células progenitoras mesenquimales1. Estas célulasmadre mesenquimales (CMM) tienen la capacidad de prolife-rar extensamente y formar colonias de células con aspectofibroblástico. Además de en la médula ósea, es posible aislarCMM en otros tejidos, entre los que se incluyen: periostio2,hueso trabecular3, músculo esquelético4, sangre periférica5,

tejido adiposo6, pulpa dental7, ligamento periodontal8 y tejidosinovial9. De entre todos ellos, el que genera más contro-versia es la sangre de cordón, ya que mientras algunos

investigadores han sido capaces de aislar este tipo decélulas10–12, otros en cambio únicamente lo consiguen demanera esporádica13,14. Por el contrario, son numerosos lostrabajos que describen la obtención de CMM a partir de teji-dos de la placenta15,16, el líquido amniótico17, la gelatina deWharton18 y del cordón umbilical (CU) completo19.

Las células obtenidas de todos estos tejidos compartennumerosas propiedades y características, lo que ha llevadoa la International Society for Cellular Therapy a establecerun conjunto mínimo de propiedades que debe cumplir unacélula para ser considerada CMM20. Estos criterios son: adhe-rencia al plástico, expresión en membrana de CD105, CD73,CD90 y ausencia de CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79� o CD19,HLA-DR, y capacidad de diferenciación en las 3 líneas básicas:hueso, cartílago y tejido graso, al ser cultivadas en las condi-ciones adecuadas y en presencia de estímulos precisos paracada estirpe celular. Desde el punto de vista funcional pode-mos considerar que esta capacidad de diferenciación es sucaracterística primordial. Otras 2 características de las CMMde especial relevancia son su capacidad para producir facto-res de crecimiento y citocinas que promuevan la expansión ydiferenciación de las células progenitoras hematopoyeticas21

y, especialmente, la capacidad para modificar la respuesta delas células inmunes inflamatorias22. Así, el efecto antiprolife-rativo, inmunomodulador y antiinflamatorio de las CMM hacentrado la atención en estas células como potenciales agen-tes terapéuticos en enfermedades causadas por el sistema

inmune, que incluyen la enfermedad injerto contra el hués-ped (EICH), el rechazo tras el trasplante de órganos sólidos ylas enfermedades autoinmunes23.

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De todos estos datos se deduce el alto potencial terapéu-ico que poseen las CMM, y de ahí el interés en su obtención

expansión in vitro. Tal como se ha comentado anterior-ente, en la actualidad la médula ósea representa la principal

uente de obtención de CMM para terapia celular. No obstante,ay que tener en cuenta que la aspiración de la médula óseaepresenta un procedimiento invasivo que requiere anestesia.demás es importante recalcar que la frecuencia de CMM en

a médula ósea decrece con la edad de manera significativa,o que dificulta su obtención en individuos adultos24,25. Todasstas consideraciones nos llevan a la conclusión de que seríatil disponer de un banco de CMM que asegurara la disponi-ilidad de estas células para tratar a todo tipo de pacientes

ndependientemente de su edad y situación patológica. Dentre todos los tejidos en los que se ha descrito la presen-ia de CMM, los que forman el CU pueden considerarse comouentes ideales para la obtención de CMM debido a su accesi-ilidad, procedimiento de obtención indoloro para el donante,ajo riesgo de contaminación viral y por tratarse de productose deshecho.

Desde el ano 2004 se ha venido desarrollando, en el senoe la Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears, elrograma Balear de Donación de Sangre de Cordón Umbili-al que se integró posteriormente en el Programa Concordia,onjuntamente con Cataluna, Aragón, Navarra, Extremadura

Cantabria. Mediante este programa se obtiene sangre deU para su conservación en un banco público y su posteriortilización en el trasplante de progenitores hematopoyéti-os de aquellos pacientes que muestran una compatibilidaddecuada. Por ello nos planteamos la posibilidad de utilizaros mecanismos y la infraestructura del Programa Concordian nuestra comunidad para obtener CU de los que deri-ar CMM y conservarlas almacenadas en un biobanco. A laslaras ventajas logísticas (mismo consentimiento informado,aracterización serológica, tipificación HLA) que abarataríanlaramente el proceso, se une el hecho de que sería posiblea conservación de los precursores hematopoyéticos a la vezue las CMM del mismo individuo, facilitando su utilizaciónerapéutica.

En el presente trabajo pretendemos demostrar que es posi-le obtener CMM a partir de los CU obtenidos conjuntamenteon las unidades de sangre de CU. Esta demostración abriríaa posibilidad de establecer un biobanco de estas células enaralelo al banco de progenitores hematopoyéticos de sangree cordón.

aterial y métodos

btención de cordones umbilicales

os CU se obtuvieron simultáneamente a la donación deangre de cordón umbilical en el Programa Concordia debtención de Sangre de Cordón Umbilical, tras la obtenciónel consentimiento informado y con la aprobación del Comitético de las Islas Baleares (CEIC-IB). Los CU se recogieron

n un frasco esterilizado y se trasladaron al Banco de Teji-os en un plazo máximo de 24 h desde su recolección. A suecepción se mantuvieron en tampón fosfato salino (PBS) a◦C hasta su procesamiento.

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Aislamiento de células madre mesenquimales a partir decordón umbilical

Después de lavar con PBS para eliminar cualquier contami-nante de sangre, el CU fue cortado transversalmente y losfragmentos (0,5-1 cm) se sometieron a digestión enzimaticadurante 3 h a 37 ◦C con agitación rotatoria en presencia dedistintas combinaciones de las enzimas colagenasa (Sigma®)al 0,075%, hialuronidasa (Sigma®) 0,05% o tripsina 0,125%(Sigma®). Después de la digestión, el tejido sobrante se eli-minó mediante filtración con un filtro de 100 �m. Se realizóun recuento para determinar el número de células viables y seresuspendieron las células en medio de crecimiento: DMEM-low glucose suplementado con 2 mM GlutaMAXTM-I (Gibco®),20% FBS Hyclone (ThermoScientific®), penicilina (100 U/ml),estreptomicina (100 �g/ml) y anfotericina B (0,25 mg/ml)(Gibco®). La suspensión se cultivó en frascos de 25 cm2 a 37 ◦Cen un incubador humidificado con una concentración de CO2

del 5%. Después de 2 días de cultivo se reemplazó el medio,pudiéndose observar al microscopio la presencia de célulasadherentes que proliferaron hasta alcanzar la confluencia. Alsuperar la confluencia el 80%, se trataron con una solución detripsina para despegarlas del frasco de cultivo. Tras compro-bar su viabilidad y ajustar la concentración se transfirieron afrascos de cultivo de 75 cm2, a una densidad de 2 × 103/cm2 yse cultivaron de nuevo con el fin de expandir el cultivo.

Recuento célula

Las suspensiones de células obtenidas de los CU digeridoso de los cultivos de células madre mesenquimales a partirde cordón umbilical (CMM-CUh) se tineron con el reactivoViaCount® (Millipore®) según lo descrito por el fabricante.Este reactivo permite distinguir entre células viables y no via-bles basándose en la permeabilidad diferencial de los tintesde unión al ADN presente en el mismo. El recuento celular sellevó a cabo mediante el citómetro de flujo Guava EasyCyteMini® (Millipore®).

Caracterización fenotípica de la célula madre mesenquimala partir de cordón umbilical

Se utilizaron técnicas estándar de citometría de flujo paradeterminar el patrón de expresión de antígenos de diferen-ciación en la superficie de estas células. De manera resumida,las células fueron incubadas con concentraciones saturan-tes de los siguientes anticuerpos monoclonales marcados confluorocromo: CD105-ficoeritrina (PE), CD90-PE-Cy5, CD73-PE,CD34-PE, CD45-fluoresceína (FITC), CD31-PE y HLA-DR-FITC(BD Biosciences®), durante 30 min a temperatura ambiente.Tras eliminar el exceso de anticuerpo mediante lavado conPBS, las células se analizaron por citometría de flujo reali-zándose la lectura de fluorescencia en un instrumento GuavaEasyCyte Mini® (Millipore®).

Diferenciación osteogénica

Las CMM-CUh se sembraron a una concentración de 5 ×104 células por pocillo en placas de 6 pocillos y se cultivaronen medio de crecimiento a 37 ◦C en un incubador humidificado

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en presencia de CO2 al 5%. Dos veces por semana se sustituyóel medio de crecimiento por medio fresco. En el momentode alcanzar la confluencia, designado como día 0, se anadiómedio de cultivo suplementado con 200 nM de hidrocorti-sona, 50 �g/ml de ácido ascórbico y 10 mM de ß-glicerofosfatopara inducir la diferenciación osteogénica. Las células fue-ron cultivadas durante 21 días, reemplazando el medio dediferenciación 2 veces por semana. Los cultivos se fijaron enformalina al 10% y fueron tenidos con Alizarin Red (Sigma®)para detectar los depósitos de calcio.

Diferenciación adipogénica

Las CMM-CUh se sembraron a una concentración de 5 ×104 células por pocillo en placas de 6 pocillos y se cultivaronen medio de crecimiento a 37 ◦C en un incubador humidificadoen presencia de CO2 al 5%. Dos veces por semana se sustituyoel medio de crecimiento por medio fresco. En el momentode alcanzar la confluencia, designado como día 0, se anadiómedio de cultivo suplementado con 60 �M de indometacina,10 �M de dexametasona y 5 mg/ml de insulina para inducir ladiferenciación adipogénica. Los cultivos fueron fijados en for-malina al 10% y se tineron con solución de Oil Red O (ThermoScientific®) para evidenciar la presencia de los lípidos intra-celulares.

Ensayo de proliferación linfocitaria

Mediante gradiente de densidad en ficoll se aislaron célu-las mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantessanos tras consentimiento informado. La proliferación se ana-lizó mediante la tinción con diacetato de carboxifluoresceínaester succinimidil (CFSE)26,27. Para ello se incubó una sus-pensión de 2 × 106/ml PBMC en PBS con CFSE a 0,125 uMdurante 5 min a temperatura ambiente. Posteriormente sebloqueó la reacción anadiendo PBS + 2% suero fetal de ter-nera (SFT). A continuación se lavaron las células 2 veces enPBS + 2% SFT, resuspendiéndose finalmente en medio de cre-cimiento+ 5% SFT. Las PBMC se cultivaron a una concentraciónde 2 × 105/pocillo. Como estímulo mitogénico se utilizó fitohe-maglutinina (PHA) (Sigma) a una concentración de 1,25 �g/ml.Las CMM-CUh se anadieron en determinados pocillos a unarelación de 1:10 respecto a las PBMC, es decir 2 × 104/pocillo.

Resultados y discusión

Comparación de diferentes enzimas para el aislamientode células mesenquimales de cordón umbilical

A pesar de la gran cantidad de publicaciones que describenel aislamiento de CMM a partir de sangre de cordón, en todasellas se coincide en reconocer la dificultad del proceso y la bajatasa de éxito en la obtención de este tipo de células, que varíasegún los autores entre un 0 y un 60% de las unidades en lasque se ensaya10–12,14. Si esto se debe a una baja frecuencia de

estas células en la sangre de cordón o es debido a las condi-ciones de cultivo (medio de cultivo, factores de crecimiento,inóculo celular inicial,. . .) es objeto de controversia. No existe,por tanto, una técnica estandarizada que asegure la obtención

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de CMM en todas las unidades de sangre de CU en las que seinicie el proceso. Bieback et al.10 han demostrado cómo opti-mizando el procedimiento de obtención y las característicasde la unidad de sangre de cordón de partida es posible pasarde una tasa de éxito en la obtención de CMM del 29 al 63%. Noobstante, estos autores no fueron capaces de obtener CMMen el 100% de las unidades incluso cuando estas eran de granvolumen y se procesaban a las pocas horas de su obtención.Donde sí parecen coincidir los autores es en que los mejoresrendimientos se obtienen cuando se parte de unidades ópti-mas, con una alta celularidad. No obstante, esto plantea elproblema de que en caso de derivarse estas unidades haciala obtención de CMM se perderían para el propósito principal,que es la conservación de precursores hematopoyéticos.

Una fuente alternativa para la obtención de CMM han sidolos tejidos que forman la placenta y el CU. Se ha demos-trado la posibilidad de aislar CMM a partir de la gelatinade Wharton, del tejido perivascular, del tejido placentarioy del CU completo15,16,18,19,28. En el caso de la placenta, lasCMM obtenidas muestran un origen tanto materno como fetal,dependiendo del tejido placentario utilizado. Así, el tejidoamniótico es una fuente de CMM de origen fetal mientrasque la decidua basalis y la decidua parietalis constituyen unafuente de CMM de origen materno.

Experimentos preliminares llevados a cabo en nuestrolaboratorio confirmaron los datos mostrados en la literatura,ya que pudimos comprobar cómo era posible obtener CMM delos tejidos placentarios y de la sangre de cordón con desigualeficacia. Los tejidos ensayados fueron: membrana amniótica(50%; n = 4), placenta coriónica (50%; n = 4), gelatina de Whar-ton (40%; n = 10) y sangre de CU (20%; n = 8). Únicamenteutilizando el UCl completo obtuvimos una eficacia en el aisla-miento de CMM del 100% (n = 40).

Con estos resultados preliminares, decidimos centrarnuestros esfuerzos en optimizar la obtención de CMM a partirde CU. Para ello realizamos un análisis comparativo de diferen-tes combinaciones enzimáticas capaces de digerir el cordóny liberar las CMM. Las combinaciones ensayadas incluyen:a) colagenasa 0,075% durante 3 h, b) tripsina 0,125% durante3 h, anadiendo colagenasa 0,075% los últimos 30 min, y c) hia-luronidasa 0,05% y colagenasa 0,075% durante 3 h.

Los CU se obtuvieron simultáneamente al proceso de dona-ción de sangre de CU y se procesaron antes de las 24 h de suobtención, no detectándose ninguna relación entre el lapso detiempo transcurrido y el rendimiento en la obtención (datosno presentados). Tras limpiar los cordones con PBS para eli-minar los restos de sangre, se obtuvo un segmento de cordónde entre 9 y 11 g, que se cortó posteriormente en fragmentostransversales de 0,5-1 cm. Estos fragmentos se incubaron conlas diferentes combinaciones enzimáticas antes mencionadasen un agitador orbital a 37 ◦C. Posteriormente se filtró el pro-ducto de digestión a través de una malla de 100 �m de tamanode poro para eliminar los restos de tejido no digerido y obte-ner una suspensión celular. Se determinó el número de célulasviables presentes en la suspensión, expresándose el resultadopor gramo de tejido.

Como puede observarse en la figura 1a, el mayor númerode células se obtiene cuando se utiliza la combinación enzi-mática de colagenasa con hialuronidasa, mientras que nohay diferencias entre la utilización de colagenasa sola o en

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800000

Cel

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A B C A B C

Figura 1 – Comparación del rendimiento celular obtenido utilizando diferentes combinaciones enzimáticas. Los cordonesumbilicales se pesaron, seleccionándose un segmento de 10 g del que se obtuvieron fragmentos transversales de 0,5-1 cm.Seguidamente se utilizaron 3 combinaciones enzimáticas para digerir los trozos de cordón umbilical y obtener unasuspensión celular: colagenasa 0,075% durante 3 h (A), tripsina 0,125% durante 3 h anadiendo colagenasa 0,075% losúltimos 30 min (B) y colagenasa 0,075% con hialuronidasa 0,05% durante 3 h (C). a) Se calculó el número de células viablestotales obtenidas después de la digestión y se dividió por los gramos de tejido cortado y digerido. b) Se contaron las célulasadherentes a los 7-10 días después de sembrar el producto de digestión en frascos de cultivo con medio de crecimiento y sed ,05.

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ividieron por los gramos de tejido digerido.** p < 0,01; * p < 0

resencia de tripsina. Con el fin de aislar las CMM presentesn la suspensión, la suspensión celular obtenida se cultivó enrascos de 25 cm2 con medio de crecimiento. A las 48 h se eli-

inaron las células no adherentes y se mantuvo el cultivo,ambiándose el medio de crecimiento 2 veces por semana. Aos 7-10 días se despegaron las células adheridas medianteratamiento con tripsina y se contaron las células viables. Elesultado se expresa como número de CMM por gramo deejido digerido. Tal como se observa en la Figura 1b, la digestiónon colagenasa y hialuronidasa fue el método que propor-ionó mayor número de células mesenquimales por gramoe tejido digerido. Asimismo, los resultados confirman queo es necesario separar los diferentes componentes del cor-ón, pudiéndose realizar la digestión sobre el tejido completo,

o que proporciona ventajas logísticas evidentes al acortar laanipulación. Este es un hecho de gran importancia si se pre-

ende aplicar este método para la obtención sistemática de lasMM, simultáneamente con las donaciones de sangre de UCl,n el contexto de un biobanco.

aracterización inmunofenotípica de las células madreesenquimales a partir de cordón umbilical

al como se ha comentado en la introducción, es amplia-ente aceptado que si bien las CMM carecen de un marcador

specífico que las identifique, sí presentan un patrón de expre-ión de antígenos de diferenciación que las define. Por ello,os propusimos comprobar si las células adherentes deriva-as de la digestión de los cordones umbilicales presentabanl patrón de expresión de moléculas de superficie caracterís-ico de las CMM. Para ello, se utilizaron células que habíanido expandidas durante 4-5 pases y se tineron con anticuer-os monoclonales conjugados con marcadores fluorescentes.

os marcadores utilizados incluían el panel básico estable-ido por la International Society for Cellular Therapy queermite definir las células mesenquimales20: CD90, CD105,D73, CD45, CD34 y HLA-DR. Se incluyó además un anticuerpo

frente a CD31, que permite identificar la presencia de célulasendoteliales29. Los resultados del análisis por citometría deflujo que se muestran en la figura 2 permiten comprobar cómotanto las células obtenidas mediante digestión con tripsina ycolagenasa (fig. 2a) como las obtenidas tras digestión con hia-luronidasa y colagenasa (fig. 2b) presentan el mismo patrónde expresión de las moléculas analizadas y que se corres-ponde con el patrón definido para las CMM. Así, se detecta entodas las células estudiadas la presencia de los marcadoresmesenquimales CD73, CD90 y CD105 mientras que en ningúncaso se detectó la presencia de marcadores propios de célulasprogenitoras hematopoyéticas como CD45, CD34 o HLA-DR.La ausencia de expresión de CD31 permite descartar que lascélulas adherentes obtenidas puedan considerarse como célu-las endoteliales. Esta última comprobación era especialmenterelevante si tenemos en cuenta que se utilizó el cordón com-pleto sin eliminar los vasos que lo integran, por lo que existíala posibilidad de obtener células endoteliales. Los resultadosmuestran, además, que no existen diferencias entre las líneascelulares obtenidas en función del tratamiento enzimático uti-lizado.

Análisis de la capacidad de diferenciación osteogénicay adipogénica

Las CMM se caracterizan fundamentalmente por su capacidadpara diferenciarse in vitro en varios tejidos mesenquimales,que incluyen básicamente hueso, cartílago y tejido adiposo.Por todo ello, y especialmente teniendo en cuenta su com-portamiento como progenitoras de tejidos bien diferenciados,estas células se han convertido en un objetivo de estudiode la mayor trascendencia en el campo de la terapia celulary la medicina regenerativa23. Para cerciorarnos de la capa-

cidad de diferenciación osteogénica y adipogénica de lascélulas obtenidas con la combinación enzimática de cola-genasa con hialuronidasa, sembramos las células en placasde 6 pocillos y las cultivamos hasta que llegaron al 100%

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HLA

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100 10 1 10 2 10 3 10 4

100 10 1 10 2 10 3 10 4 100 10 1 10 2 10 3 10 4

100 10 1 10 2 10 3 10 4

Plot P07, gated on cel

Plot P06, gated on cel

Plot P07, gated on cel

Plot P06, gated on cel

Plot P06, ungated

Plot P07, gated on cel

100

a b

Figura 2 – Inmunofenotipo de las CMM aisladas mediante diferentes digestiones enzimáticas. Las células adherentesobtenidas mediante la digestión enzimática de cordón umbilical con colagenasa y tripsina (a) o con colagenasa yhialuronidasa (b), según se describe en el apartado «Material y métodos», se expandieron en cultivo durante 4-5 pases yposteriormente se analizaron por citometría de flujo tras incubación con anticuerpos fluorescentes frente a los antígenos dediferenciación CD105, CD90, CD73, CD45, CD34, CD31 y HLA-DR. La curva en negro corresponde a la senal de base, mientrasque la curva en gris corresponde al anticuerpo marcado.

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de confluencia. En este punto anadimos factores de dife-renciación al medio de crecimiento, renovándolo cada 3-4 días. Tras 21 días en cultivo, las células cultivadas en pre-sencia de estímulos adipogénicos se fijaron y se tineron conOil Red O. Tal como se observa en la figura 3b, la presenciade vacuolas lipídicas intracelulares en las células incubadascon medio adipogénico es evidente en comparación con lascélulas cultivadas sin estimulo (fig. 3a), confirmando la dife-renciación de las CMM hacia la estirpe adipogénica. Asimismo,las células cultivadas en paralelo en presencia de estímu-los osteogénicos fueron fijadas y tenidas con alizarina. Talcomo se observa en la microfotografía (fig. 3d), la tinción per-mitió revelar la presencia de depósitos de calcio, productode la diferenciación ostogénica, mientras que estos depósi-tos no se detectaron en las células igualmente tenidas peroque no habían sido tratadas con estímulos diferenciadores(fig. 3c).

Actividad inmunosupresora de las células madre

mesenquimales a partir de cordón umbilical

Una de las propiedades características de las CMM es sucapacidad para suprimir la proliferación linfocitaria. Con la

finalidad de determinar si las CMM derivadas de CU poseíantambién esta propiedad, ensayamos la capacidad de estascélulas de inhibir la proliferación de linfocitos de sangre peri-férica estimulados con el mitógeno PHA. Para monitorizarla activación y proliferación celular los linfocitos se tineroncon CFSE. Este colorante se incorpora pasivamente al cito-plasma de las células donde se une de manera irreversible alas proteínas intracelulares, adquiriendo en el proceso propie-dades fluorescentes. Al dividirse la célula, el CFSE presenteen el citoplasma se reparte por igual entre las 2 célulashijas, por lo que la intensidad de fluorescencia disminuye enconsecuencia a la mitad26. Al analizar la suspensión celularmediante citometría de flujo, esta disminución secuencial dela fluorescencia se evidencia como diferentes picos y puedeutilizarse para monitorizar la progresión de las divisionescelulares27.

Tal como se describe en el apartado «Material y métodos»,se obtuvieron PBMC y se tineron con CFSE. Posteriormenteestas células se incubaron en presencia de medio de cultivo,

PHA o PHA + CMM-CUh y a los 5 días se analizaron mediantecitometría de flujo. En la figura 4 podemos observar cómolos linfocitos tenidos y mantenidos en presencia de mediode cultivo presentan un único pico de fluorescencia (línea

i n m u n o l o g í a . 2 0 1 3;3 2(1):3–11 9

Figura 3 – Diferenciación adipogénica y osteogénica de CMM-CUh. Las CMM-CUh se sembraron en placas de 6 pocillos y secultivaron hasta la confluencia. En este punto las células control se siguieron cultivando con medio de crecimiento (a y c) ose anadieron factores de diferenciación adipogénicos (b) u osteogénicos (d). A los 21 días de tratamiento las células fueronfijadas y tenidas con Oil Red O para evidenciar depósitos de lípidos intracelulares (a y b) o con Alizarin Red para evidenciard e de

dacc

Fic(1cdieql

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epósitos de calcio (c y d). Las flechas marcan la presencia d

e rayas), ya que las células se mantienen en reposo ante la

usencia de estímulo. Por el contrario, las células estimuladason PHA (línea continua) muestran diversos picos de fluores-encia correspondientes a los sucesivos ciclos de proliferación,

100 101 102

CSFE

103 104

igura 4 – La proliferación linfocitaria inducida por PHA esnhibida en presencia de CMM-CUh. 2 ×105 PBMC marcadason CFSE se estimularon mediante la adición de PHA1,25 �g/ml) en presencia (. . .) o ausencia (—) de 2 ×04 CMM. Al final del periodo de incubación (5 días) lasélulas se analizaron por citometría de flujo. Como controlel marcaje se utilizaron PBMC marcadas con CFSE,

ncubadas durante el mismo periodo en ausencia destímulo (—). El marcador M1 delimita la fracción celularue ha permanecido en reposo, mientras que M2 muestra

a fracción de células que han proliferado.

positos de lipidos (c) y de calcio (d).

de tal manera que únicamente un 25,79% de las células seencuentran en la región M1, correspondiente a las célulasen reposo. Cuando los linfocitos fueron estimulados con PHAen presencia de CMM-CUh (línea de puntos), si bien se observaproliferación celular, esta es mucho menor que en el grupocontrol, siendo el porcentaje de células que permanecen enreposo, en la región M1, del 52,05%. Estos datos, representa-tivos de 4 experimentos, confirman el poder inmunosupresorque poseen las CMM y que también está presente en las CMM-CUh.

Estos resultados coinciden con las observaciones quemuestran que cuando las CMM están presentes en un cul-tivo mixto linfocitario o se anaden a cultivos de linfocitosestimulados con mitógenos, se observa una supresión de laproliferación celular T de manera dosis dependiente30. Estasupresión es independiente de MHC y, en seres humanos,parece ser mediada por factores solubles, ya que la prolife-ración se mantiene si las CMM y los linfocitos se encuentranseparados por un sistema «transwell»31. Además, los resul-tados de los experimentos in vitro han sido corroboradospor datos obtenidos en modelos experimentales animales. Enun modelo murino de encefalomielitis autoinmune, Zappiaet al.32 han demostrado que la infusión de CMM determina unamejoría notable en la evolución de la enfermedad, siempre ycuando las células se administren al inicio de la enfermedad odurante el pico de la misma, pero no tras la estabilización delproceso. En experimentos in vivo, Tian et al.22 han observado

que las CMM alogénicas permanecen inalteradas durante unperiodo más prolongado del que lo hacen otras células alogé-nicas en las mismas condiciones, lo que lleva a estos autoresa sugerir que las CMM ni son capaces de iniciar ni son el

a . 2 0

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objetivo de respuestas inmunes en base a un reconocimientoalogénico33.

De los modelos animales se ha pasado ya a la utili-zación clínica de estas células. Así, recientemente se hanpublicado varios trabajos en los que se muestra la poten-cialidad de las CMM en el tratamiento de la EICH. Ringdenet al.34 describen una desaparición total de la EICH en 6 de8 pacientes tratados con la infusión de CMM alogénicas condiferentes grados de compatibilidad HLA. Además, su tasade supervivencia fue significativamente mayor que la de 16pacientes con EICH demostrada mediante biopsia gastroin-testinal que no fueron tratados con CMM durante el mismoperiodo35. Uno de los principales problemas con el que seenfrenta esta opción terapéutica es el de obtener las célu-las y expandirlas hasta alcanzar un número adecuado enel lapso de tiempo suficiente para poder ser administradascon garantías de eficacia. Además de en el trasplante deprogenitores hematopoyéticos, la utilización de CMM en eltrasplante de órgano sólido despierta crecientes expectativas,ya que los modelos de trasplante preclínicos han demostradola eficacia de las CMM para prolongar la supervivencia delinjerto36.

Numerosas enfermedades crónicas son el resultado delfracaso en los procesos de reparación o regeneración. Lasaproximaciones terapéuticas actuales se basan en la sustitu-ción del órgano o tejido danado por medios farmacológicoso mediante trasplante, en ocasiones con resultados limita-dos. La existencia de células madre en la etapa posnatal, conplasticidad para diferenciarse hacia distintos tejidos, funda-menta su utilización en la regeneración tisular. La capacidadde estas células de escapar al control del sistema inmuney su potencial tolerizante que apunta a su utilidad en elcontrol de la respuesta de rechazo o de EICH, justifica lacreación de un banco alogénico de uso investigacional eincluso clínico. Las ventajas del mismo son la bioseguridadde producto, la disponibilidad inmediata y la consiguienteuniversalización de su uso. Además, al tratarse de células jóve-nes se minimizan los riesgos de haber acumulado mutacionesgenéticas.

Los resultados que presentamos en el presente trabajoconfirman la hipótesis inicial al mostrar cómo es factible,en el contexto de un banco de sangre de CU, desarrollarun banco de CMM obtenidas a partir del CU. Esta estrate-gia nos permite disponer de manera simultánea tanto de lasCMM como de los progenitores hematopoyéticos del mismodonante. Este hecho conlleva la ventaja anadida de disponerde los datos serológicos y de tipificación HLA de estas células,que una vez almacenadas y caracterizadas podrían utilizarsedurante la fase aguda de lesiones tisulares y además com-plementar otras terapias como la facilitación del trasplantede sangre de cordón, la expansión ex vivo de células madrehematopoyéticas y la inducción de tolerancia inmunológicaen situaciones como la EICH, el rechazo de órganos sólidoso las enfermedades autoinmunes. El hecho de almacenarcélulas funcionales ya expandidas elimina los inconvenien-tes que implica su producción a partir de donantes adultos:coste, individualización y tiempo de producción. A la vezevita la situación de base (enfermedades subsidiaria, edad...)que el donante pueda tener en el momento de la indicaciónterapéutica.

1 3;3 2(1):3–11

Financiación

Este trabajo ha podido ser realizado gracias a la financiaciónobtenida en los proyectos PI07-1021 y PLE2009-0102.

Responsabilidades éticas

Protección de personas y animales. Los autores declaran quepara esta investigación no se han realizado experimentos enseres humanos ni en animales.

Confidencialidad de los datos. Los autores declaran que eneste artículo no aparecen datos de pacientes.

Derecho a la privacidad y consentimiento informado. Losautores han obtenido el consentimiento informado de lospacientes y/o sujetos referidos en el artículo. Este documentoobra en poder del autor de correspondencia.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Los autores agradecen la excelente asistencia técnica de CeliaOrdinas y Cristina Corbillo así como la colaboración de JavierPena en la elaboración del material gráfico.

i b l i o g r a f í a

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